1.- Introducción al procesado para microscopía electrónica:
Cuando observamos muestras al microscopio electrónico estas han de tener un grosor adecuado para que los electrones puedan atravesarlas y formar una imagen. El grosor con el que normalmente se trabaja está entre 250 a 500 Amstrongs, lo que implica que antes han de obtenerse secciones del material biológico a estudiar. Para ello se requiere un procesado de la muestra.
Las muestras biólogicas primeramente se fijan. La fijación consiste en matar las células, preservando sus características estructurales y bioquímicas. Para ello en microscopía electriónica se utilizam fijadores de tipo aldehídico (paraformaldehido y glutaraldehido) ya que son los que dan una mejor preservación ultraestructural.
Una vez fijada, la muestra se incluye en algún material que le dé suficiente consistencia para poder obtener secciones. Los materialse más utilizados son las resinas de tipo Araldita y Epoxy (Spurr). Estas resinas presentan como característica que no son miscibles con el agua, por lo cual la muestra biológica deben sufrir una deshidratación para sustituir el agua por un disolvente orgánico que sí es miscible con la resina. Los disolventes más utilizados son el etanol y la acetona. Por último, la muestra puede continuar el proceso de inclusión en una resina en estado líquido que polimerizará a temperaturas de 60ºC.
Protocolo de inclusión en Spurr:
Muestra: cultivo celular sobre placa de 35 mm.
1.- Lavado con PB 0.1 M (pH 7.4). 3 por 5 min.
2.- Fijación: 2% paraformaldehido-2.5% glutaraldehido en PB 0.1 M. 1 hora.
3.- Lavado con PB 0.1 M. 3 por 5 min.
4.- Scrapper y centrifugación a 2500 rpm 5 min.
5.- posfijación: tretaóxido de osmio 1% en PB 0.1 M. 1 hora a 4ºC.
6.- Lavado con PB 0.1 M. 3 por 10 min.
7.- Deshidratación con Acetonas:
Acetona 50% 15 min.
Acetona 60% 15 min.
Acetona 70% 15 min.
Acetona 80% 15 min.
Acetona 90% 15 min.
Acetona 96% 2 por 15 min.
Acetona 100% 2 por 15 min.
8.- Infiltracion de resina:
1 vol. resina: 3 vol. acetona 100% 2 horas.
2 vol. resina: 2 vol. acetona 100% 3 horas.
3 vol. resina: 1 vol. acetona 100% 5 horas.
Resina pura 2 horas.
Resina pura toda la noche.
Resina pura 2 horas.
9.- Confección de bloques y polimerización a 60ºC durante 48 horas.
Una vez incluida la muestra puede ser cortada en un ultramicrotomo y los cortes son recogidos, en soportes especiales para el microcscopio electrónico (rejillas de cobre o oro). Debido a que el material biológico permite el paso de los electrones, los cortes deben contrastarse con sales de metales pesados como el acetato de uranilo o el citrato de plomo. Así podrán visualizarse las membranas y los orgánulos celulares.
Las técnicas inmunocitoquímicas para microscopía electrónica se basan en los mismos conceptos que para microscopia óptica, los sitios de reacción de los anticuerpos deben ponerse de manifiesto con algún marcador electrondenso (oro coloidal, ferritina) que podrá visualizarse al microscopio electrónico.
El procesado de muestras para inmunocitoquímica para microscopia electrónica debe tener como prioridad: Facilitar la entrada del complejo anticuerpo-marcador, conservar la antigenicidad y mantener una óptima conservación de la ultraestructura.
Existen varios procedimientos para conseguir dichos objetivos, que bàsicamente pueden agruparse en las técnicas de pre-inclusión i las técnicas de post-inclusión.
2.- Las Técnicas Pre-inclusión:
Las técnicas pre-inclusión (marcar antes de incluir) se utilizan básicamente para el estudio de antígenos de membrana celular, subfracciones celulares y microrganismos. Es una de las técnicas mas sensibles y permite trabajar con muestras fijadas o sin fijar (en este último caso deberá trabajarse a 4ºC para evitar la degradación y en consecuencia la mala calidad ultraestructural). Después las muestras se fijan con paraformaldehido y glutaraldehido y tetróxido de osmio; finalmente se procesan para ultramicrotomía y pueden ser observadas.Esta técnica preserva en óptimas condiciones la ultraestructura de las muestras y permite una muy buena localización de los antígenos de superficie.
La localización de antígenos del interior celular requiere de una acción química o física para la permeabilización de las membranas (un detergente (triton X-100), choque osmótico) para que los anticuerpos puedan llegar a los epítopos, esto provoca una mala preservación ultraestructural, un desplazamiento de los antígenos (relativamente importante) y posibilita la aparición de falsos negativos por la retención de los anticuerpos.
Un método alternativo para el estudio de antígenos intracelulares con técnicas de pre-inclusión es la obtención de secciones de tejido en un vibrotomo o criostato, que pueden ser inmunodetectadas y posteriormente incluidas para ultramicrotomía.
Protocolo de inmunomarcaje e inclusión para técnicas de Pre-inclusión:
Este protocolo permite el inmunomarcaje de antígenos de superficie celular.
Tipo celular: Fibroblastos humanos crecidos sobre placas de 35 mm.
1.- Fijación: 2% paraformaldehido-0.1% glutaraldehido en PB 0.1 M (pH 7.4) 1 hora a 4ºC.
2.- Lavados con PBS 0.1 M glicina 20 mM. (solución A),3 por 5 min.
3.- Bloqueo con PBS 0.1 M glicina 20 mM. 1% BSA. (solución B), 20 min.
4.- Anticuerpo primario en solución B., 1 hora. (400 ul/placa)
5.- Lavados con solución A., 3 por 5 min.
6.- Marcador electrodenso (proteina A oro coloidal) en solución B., 45 min. (400ul/placa).
7.- Lavados con PB 0.1 M., 3 por 5 min.
8.- Post-fijación. 2% paraformaldehido-2.5% glutaraldehido en PB 0.1 M 1 hora a 4ºC.
9.- Lavados con PB 0.1 M., 3 por 10 min.
10.- Post-fijación y contrastado con tetraóxido de osmio 1% en PB 0.1 M 1 hora a 4ºC.
11.- Lavados con PB 0.1 M. 3 por 10 min.
12.- Scrapper y recogida del pellet celular por centrifugación a 2500 rpm 5 min.
13.- deshidratación con acetonas.
14.- inclusión en resina Spurr.
3.- Las técnicas de post-inclusión:
Las técnicas de post-inclusión se basan en la obtención de secciones ultrafinas de la muestra y sobre estas se realiza la inmunodetección de los antígenos a estudiar. Por tanto las muestras son primero fijadas, incluidas, cortadas y montadas sobre las rejillas antes de hacer el inmunomarcaje.
Este método permite la localización de antígenos de superficie y intracelulares.
El procesado de las muestras por inclusión requiere que las muestras sean deshidratadas con disolventes orgánicos (acetonas o alcoholes) lo cual implica una alteración de antígenos que puede disminuir la antigenicidad de la muestra. Al mismo tiempo la polimerización de las resinas más comunmente utilizadas (Araldita y Epoxy) a temperaturas alrededor de 60ºC incrementa dicha pérdida.
Una alternativa és la inclusión en plásticos de tipo metacrilato (Lowicryl K4M y LR White) ya que el deshidratado se realiza con alcoholes a bajas temperaturas (-20º y -35ºC) con menor desplazamiento y alteración de los antígenos al mismo tiempo que el plástico polimeriza a -35ºC gracias a la acción de los rayos U.V.
El método idóneo para una buena preservación de la antigenicidad es la obtención de secciones ultrafinas por congelación (crioultramicrotomía); la muestra es fijada con fijadores aldehídicos (paraformaldehido y concentraciones bajas de glutaraldehido), crioprotegida con sacarosa 2.3 M (evita el crecimiento de los cristales de hielo), congelada por inmersión en nitrógeno líquido y es seccionada a bajas temperaturas (-80º a -120ºC) en un crioultramicrotomo. Los cortes son recogidos sobre rejillas y pueden ser llevados a temperatura ambiente para su inmunomarcaje. Finalmente, los cortes pueden ser contrastados con acetato de uranilo y embebidos en metil celulosa para evitar que se sequen.
La técnica de inmunocitoquímica por crioultramicrotomía requiere que las muestras sean procesadas inmediatamente después de la obtención de cortes ya que el secado provocaría detección inespecífica; mientras que el procesado por plásticos de tipo metacrilato permite el almacenamiento de los cortes hasta su inmunomarcaje.
Protocolo de inclusión en Lowicryl:
Cultivo celular sobre placa de 35 mm.
1.- Lavado con PB 0.1 M (pH 7.4) 3 por 5 min.
2.- Fijación: 2% paraformaldehido-0.1 a 0.5% glutaraldehido en PB 0.1 M. (pH 7.4) 1 hora a 4ºC.
3.- Lavado con PB 0.1 M.
4.- Deshidratación en alcoholes:
Alcohol 30% 50 min. a 4ºC.
alcohol 50% 50 min. a -20ºC.
alcohol 70% 50 min. a -20ºC.
alcohol 90% 50 min. a -20ºC.
alcohol 96% 50 min. a -20ºC.
alcohol 100% 50 min. a -20ºC.
5.- Infiltración de resina:
2 vol. resina: 2 vol. alcohol 100%. 1 hora a -20ºC.
3 vol. resina: 1 vol. alcohol 100%. 1 hora a -35ºC.
resina pura. 8 horas a -35ºC.
6.- Confección del bloque y polimerización de la resina: 48 horas a -35ºC bajo luz U.V.
Inmunomarcaje de cortes obtenidos de bloques de Lowicryl:
Cortes sobre rejillas de oro con membrana de fomvar.
1.- Hidratación-bloqueo. PBS 0.1 M glicina 0.1 M., 2 por 5 min.
2.- Blogueo. Ovoalbúmina 2% en PBS 0.1 M., 30 min.
3.- Anticuerpo primario diluido en Ovoalbúmina 1% en PBS 0.1 M., 2 horas en cámara húmeda.
4.- Lavado con PBS 0.1 M glicina 0.1 M., 3 por 5 min.
5.- Marcador electrodenso diluido en ovoalbúmina 1% en PBS 0.1 M., 1 hora en cámara húmeda.
6.- Lavados con PBS 0.1 M., 2 por 5 min.
7.- Jet wash. 10 ml. de agua mQ/rehilla.
8.- Contrastado: acetato de uranilo al 2%. 10 min, Citrato de plomo. 5 min.
Protocolo standard de preparación de muestras para crioultramicrotomía:
Cultivo celular sobre placa de 35 mm.
1.- Lavado con PB 0.1 M (pH 7.4). 3 por 5 min.
2.- Fijación: 2% paraformaldehido-0.1 a 0.5% glutaraldehido en PB 0.1 M. 1 hora a 4ºC.
3.- Lavado con PB 0.1 M (pH 7.4). 3 por 5 min.
4.- Scrapper y centrifugación a 2500 rpm 5 min.
5.- Englobación del pelet en gelatina al 10% en PB 0.1 M a 37ºC.
6.- Centrifugación a 2500 rpm 5 min a 20ºC.
7.- Post-fijación: 2% paraformaldehido en PB 0.1 M a 4ºC. 8 horas.
8.- Crioprotección: 2.3 M sacarosa. 8 horas.
9.- montaje i congelación por inmersión en nitrógeno líquido.
Inmunomarcaje de cortes obtenidos por crioultramicrotomía:
Cortes recogidos sobre rejillas de oro con membrana de fomvar.
1.- Lavado con PBS 0.1 M glicina 20 mM. (solución A). 3 por 5 min.
2.- Bloqueo con PBS 0.1 M glicina 20 mM. 1% BSA (solución B). 20 min.
3.- Anticuerpo primario diluido en solución B. 30 min.
4.- Lavados con solución A. 3 por 5 min.
5.- Marcador electrodenso diluido en solución B. 20 min.
6.- Lavados con PBS 0.1 M. 3 por 5 min.
7.- Lavados con agua mQ. 6 por 5 min.
8.- Contrastado y confección de membrana de metil celulosa 0.3% acetato de uranilo. 10 min. a 4ºC.
4.- Práctica: Inmunomarcaje de cortes de Lowicryl de hepatocitos aislados de rata:
Cortes sobre rejillas de oro con membrana de fomvar. Todo el procesado se realiza sobre un parafilm sobre el cual se colocan gotas de los reactivos y las rejillas invertidas encima de ellas.
1.- Hidratación-bloqueo. PBS 0.1 M glicina 0.1 M.(1 ml./gota), 2 por 5 min.
2.- Blogueo. Ovoalbúmina 2% en PBS 0.1 M.(1 ml./gota), 30 min.
3.- Anticuerpo primario diluido en Ovoalbúmina 1% en PBS 0.1 M.(10ul/ gota/ rejilla), 2 horas en cámara húmeda:
Rabbit anti Tubulina 1:100
Rabbit anti Colágeno 1:40
4.- Lavado con PBS 0.1 M glicina 0.1 M.(1 ml./gota), 3 por 5 min.
5.- Marcador electrodenso diluido en ovoalbúmina 1% en PBS 0.1 M.(10ul/ gota/ rejilla), 1 hora en cámara húmeda:
Proteína A-Oro coloidal 15 nm. 1:50
6.- Lavados con PBS 0.1 M.(1 ml./gota), 2 por 5 min.
7.- Jet wash. 10 ml. de agua mQ/rehilla.
8.- Contrastado:
Acetato de uranilo al 2%. (200 ul/gota)10 min.
Lavado con agua (jet wash) y secado.
Citrato de plomo. 5 min.
Lavado con agua (jet wash) y secado.
Soluciones:
PBS 0.1 M. glicina 0.1 M:
0.65 gr glicina/50 ml. PBS 0.1M.
PBS 0.1 M. 2% ovoalbúmina:
0.02 gr/10 ml. PBS 0.1M.
PBS 0.1 M. 1% ovoalbúmina:
0.01 gr/10 ml. PBS 0.1M.
Beesley,J.E. Colloidal Gold: A New Perspective for Cytochemical Marking. Oxford University Press. Royal Microscopical Society. 1989.
Durfort,M. Vilaró,S. Renau,J y Serratosa,J. Técnicas de Inmunocitoquímica en Microscopía Electrónica. Publicacions Universitat de Barcelona. 1[[ordfeminine]] Edició. 1991.
Larson,L-I. Immunocytochemistry: Theory and Practice. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida.
Vilaró, S. Soriano,E. Técniques de Immunocitoquímica. 1993. Unitat de Biologia Cel.lular. Departament de Bioquímica i Fisiologia. Universitat de Barcelona.
Material docente diseñado y elaborado por Manuel Reina. Última actualización : 20/10/2003 10:23 . Comentarios : mreina@ub.edu