Introducció
 

Principis fisiològics

La sang de vertebrats constitueix una especialització del medi intern. Es un teixit conjuntiu, en el que el volum varia segons l'espècie, representant a l'especie humana el 8% del pes corporal. La sang és un líquid complex amb un pes específic de 1,055 g/ml. Està composta per plasma (55%) i cèl·lules: eritròcits (44%), leucòcits i plaquetes (1%).

Funcions

• Transport de gasos respiratoris (O2 i CO2), nutrients, metabòlits, hormones i enzims, entre d'altres
• Regulació hormonal i de temperatura.
• Protecció homeostàtica i immunitària
• Homeostàtica, com manteniment del medi intern.

Les cèl·lules sanguínies son les que fan la funció de transport de gasos respiratoris i de protecció immunològica davant agents estranys. 

La funció de transport la porten a terme els eritròcits (també anomenats hematies o glòbuls vermells), cèl·lules molt especialitzades. Tenen forma variable segons els grups animals. Si bé en gairebé tots els grups de vertebrats els eritròcits són nucleats, biconvexos i generalment el·líptics, en els mamífers (a part dels camèlids) són anucleats i discoïdals.

Els eritròcits contenen un pigment proteic en concentració elevada, l'hemoglobina, que es combina reversiblement (en relació amb la pressió parcial del gas) amb l'O2 i el CO2. Cada hemoglobina està formada per quatre subunitats, cadascuna amb un grup hemo (responsable del color vermell i al qual s'uneix una molècula d'O2) i una globina (responsable de les interaccions al·lostèriques que modifiquen l'afinitat a l'O2 i a la que es fixa el CO2).

La funció de transport d'oxigen per la sang vindrà condicionada, en primer lloc, per la quantitat d'hemoglobina circulant, la qual dependrà del nombre d'eritròcits i de la concentració eritrocítica del pigment.

Desenvolupament
 

Determinació dels paràmetres més representatius de la sang: comptatge globular (RBC), hematòcrit (HC), i hemoglobina (Hb), amb mètode manual i mètode automàtic.

Càlcul dels índexs hematimètrics: volum corpuscular mitjà (VCM), hemoglobina corpuscular mitjana (HbCM) i concentració d'hemoglobina corpuscular mitjana (CHbCM).

Material

Centrífuga 

Centrífuga microhematòcrit

Espectrofotòmetre

Analitzador hematologia automàtic

Dispositiu mèdic o veterinari utilitzat per detectar i analitzar els components cel·lulars de la sang, principalment que inclou glòbuls blancs, glòbuls vermells, plaquetes, etc. Utilitza tecnologies òptiques, electròniques i d'altres tipus per explicar, classificar i observar la morfologia de les mostres de sang. L'analitzador de cèl·lules sanguínies té un valor d'aplicació important a l'examen clínic, la prevenció de la malaltia, el diagnòstic i el tractament.

Microscopi

Pipetes automàtiques

Pipeta comptaglòbuls

Cambra de Thoma o Neubauer

Agitador de tubs

Procediment

Obtenció de la mostra

• Treure sang per punció cardíaca en rata
• Guardar en tub heparinitzat a la nevera a 4ºC
• Abans d'analitzar cada paràmetre, resuspendre la sang amb agitador de rodet o de placa

A. Mètode manual

Comptatge globular amb càmera de Thoma o Neubauer

Aquesta mesura es fa mitjançant una pipeta comptaglòbuls i una cambra de Thoma o de Neubauer que presenta una quadrícula especial. El comptatge s’expressa en milions de glòbuls per mm³ de sang (milions d’eritròcits/mm³). La disminució del nombre indica una anèmia i l'augment, una policitèmia.

Dilució de la sang

• S'introdueix la punta de la pipeta comptaglòbuls, col·locant-la en posició gairebé horitzontal, i s'aspira per fer pujar la sang fins al senyal 0,5 de la pipeta. Si la sang passa del senyal, es pot fer retrocedir tocant l'extrem de la pipeta amb un paper de filtre, per eliminar el volum excedent. És important no passar-se de la marca 0,5.
• És important netejar de sang la superfície de la pipeta amb paper de filtre i vigilar de no perdre mostra de l'interior.
• Amb la punta de la llengua s'ha de tapar el tub de goma, submergir la punta de la pipeta al líquid de dilució (sèrum fisiològic al 0,9 %) i aspirar fins que aquest líquid arribi al senyal 101. En submergir la punta, cal aspirar al principi amb rapidesa per evitar que part de la sang de la pipeta passi a líquid. És important no passar-se.
• Cal tapar, amb el polze, la punta de la pipeta, treure el tub de goma i tapar l'altre extrem amb l'índex (o a la inversa, com sigui més còmode). S'ha de girar la pipeta, així sostinguda, diverses vegades per barrejar el contingut. Així, la sang s'ha diluït a 0,5/100 o 1/200.

Aplicació a la cambra de Thoma o de Neubauer

Vídeo ús cambra de Thoma: https://youtu.be/G0wmfyn3hqA

• S'ha de desengreixar la cambra i un cobreobjectes, el qual es col·loca sobre la zona de comptatge.
• Es fa tocar la punta de la pipeta diverses vegades amb un paper de filtre per eliminar el líquid contingut al capil·lar, ja que conté només diluent. És important que abans d'aquest pas es torni a barrejar el contingut girant la pipeta diverses vegades, ja que durant la preparació de la cambra els glòbuls es poden haver sedimentat parcialment.
• Tot seguit es fa tocar la punta de la pipeta amb el cantó del cobreobjectes (sobre l'elevació longitudinal central, entre els dos sòcols de la cambra). La suspensió d'eritròcits no hauria de sobrepassar el sòcol transversal central (si n'hi ha). Alternativament, es pot dipositar una petita gota i després col·locar-hi a sobre el cobreobjectes (encara que aquest sistema és menys fiable).
• Després d'uns minuts perquè sedimenten les cèl·lules, s'observa al microscopi amb un objectiu d'augment mitjà.

Comptatge

• La cambra de Thoma o Neubauer consta d'una quadrícula central (1 mm2) amb 16 quadres grans (4 × 4), separats per línies divisòries. Cadascun d'aquests quadrats està dividit en 25 quadradets petits de 1/400 mm² de superfície.
• Si els eritròcits s'han repartit homogèniament per tota la quadrícula, es procedeix al comptatge (en cas contrari caldria repetir l'aplicació a la cambra). Per això es compten, de 5 dels quadrats grans, tots els eritròcits als 16 quadradets petits no dividits. Dels 4 costats de cada quadrat gran, només es consideren “dins” les cèl·lules que
  estiguin sobre 2 d’aquests costats. En total s’hauran comptat 5×16 = 80 quadradets.

Càlcul

• El volum de líquid de la part de la cambra on es realitza el comptatge és:

               1/400 mm² (àrea d'un quadradet) × 80 (nombre de quadradets) × 0,1 mm (fondària càmera) = 0,02 mm³.

• El nombre de cèl·lules per mm³ de suspensió diluïda serà:

                número comptat / 0,02 = número contat × 50.

• La dilució a la pipeta és de 1/200; per tant, el nombre d'eritròcits per mm³ de sang serà:

                 número comptat × 50 (factor dependent de volum) × 200 (factor de dilució).

• Per expressar-ho en milions d'eritròcits per mm³, l'únic que s'haurà de fer és dividir el número comptat per 100.

Valoració de l'Hb mètode manual

S'utilitzarà el mètode de Drabkin, que es basa en la conversió de l'hemoglobina d'una mostra de sang a cianmetahemoglobina i la determinació fotomètrica d'aquesta. Prèviament s'haurà de tenir confeccionada una recta patró amb cianmetahemoglobina comercial.

Drabkin

El reactiu de Drabkin que produeix la conversió té la següent composició: Ferrocianur potàssic 200 mg Cianur potàssic 50 mg Bicarbonat potàssic 1g aigua destilada qsp 1L. Es estable durant un mes a 4 °C i en foscor.

Recta patrò

Construcció de la recta patró de l'hemoglobina:

De cadascun dels vials agafar els 10 µL corresponents i mesurar-ne l'absorbància.

Exemple recta patró: g Hb/dL sang = (A₅₄₀ – 0,0036) / 0,0301

Preparació de la mostra

1. Posar 2,5 mL de solució Drabkin en dos tubs d'assaig (2 x 2,5 mL).
2. S'hi afegeixen 10 µL de sang (prèviament barrejada) o 110 µL d'aigua per al blanc. Tenir cura de no enfonsar excessivament la punta de la pipeta dins la sang.
3. S'agita amb força per aconseguir una homogeneïtzació completa.
4. Deixar reposar i desprès de 10 min.
5. Llegir en un espectrofotòmetre a 540 nm, el zero del qual s'ha ajustat amb el blanc.
6. Si queden flòculs en suspensió, cal centrifugar abans de fer-ne la lectura.

Vídeo preparació de la mostra amb Drabkin

Hematòcrit mètode manual

Es determina mitjançant capil·lars heparinitzats i centrifugant en una centrífuga de microhematòcrit.

Expressa el volum d'eritròcits que hi ha en 100 ml de sang (volum cel·lular x 100/volum de sang). Normalment els leucòcits i les plaquetes contribueixen a l'hematòcrit en un grau negligible, referit al tant per cent de volum de sang. El valor de l'hematòcrit varia amb l'espècie i en relació amb el nombre i la mida dels eritròcits així com amb el volum de plasma. Un hematòcrit reduït pot ser un indicador d'anèmia i un valor elevat (65 %) s'observa en casos de deshidratació, com el còlera (a causa de les pèrdues considerables de líquid en la defecació, amb la consegüent reducció del volum plasmàtic). 

El valor de l'hematòcrit constitueix un índex indirecte de la capacitat de transport d'oxigen de la sang i és un paràmetre important per detectar una anèmia o una policitèmia.

1. Resuspendre les cèl·lules per inversió
2. Submergir el capil·lar a la sang per un dels seus extrems. Per afavorir l'entrada de sang convé mantenir el capil·lar gairebé horitzontal.
3. Quan falti mig centímetre per omplir el capil·lar, obturar l'extrem amb la plastilina i netejar la sang exterior.
4. Col·locar els capil·lars a la centrífuga de microhematòcrit de manera que l'extrem amb la plastilina estigui en contacte amb la goma del rotor.
5. Ajusteu bé la primera coberta de la centrífuga.
6. Tancar la centrífuga. 
7. Centrifugar a 1.100 rpm durant 5-6 minuts.

Vídeo preparació hematòcrit: https://hdl.handle.net/2445/5542

Vídeo centrifugació hematòcrit: https://hdl.handle.net/2445/5201

Càlcul Hematòcrit

Determinar el percentatge ocupat pels eritròcits i la sang, utilitzant una plantilla graduada.

Com que els capil·lars no estan graduats, és necessari determinar la longitud ocupada per la columna d’eritròcits i la longitud ocupada pel volum total de sang a fi i efecte de calcular els percentatges corresponents. Això se simplifica utilitzant unes plantilles que estan a la vostra disposició. El capil·lar se situa de manera que la part inferior de la columna d’eritròcits quedi al mateix nivell que el costat del triangle i la part superior de la columna de plasma s’ajusti exactament amb el costat superior del triangle. L’hematòcrit ve donat pel punt d’intersecció sobre el costat calibrat de la línia que passa per la zona que separa els eritròcits de la resta de sang.

B. Mètode automàtic

Comptatge amb comptador de partícules

Els comptadors de partícules utilitzen el sistema Coulter, que és un sistema no òptic en què una suspensió de cèl·lules sanguínies circula a través d'una obertura al mateix temps que hi passa un corrent elèctric. El pas de cada cèl·lula produeix un canvi d'impedància (resistència) en l'obertura segons la mida de la cèl·lula. El comptador relaciona la mida amb el tipus de cèl·lula. El nombre de cèl·lules comptades és unes 100 vegades superior a les comptades en els recomptes microscòpics (manuals), de manera que es redueix l'error.

• El nombre de polsos elèctrics indica el nombre de partícules que passen per l'obertura i la mida dels polsos és proporcional al volum de les partícules.
• Els comptadors Coulter fan el recompte d'eritròcits, leucòcits i plaquetes per triplicat.

Els comptadors de partícules disposen de dos banys, un d'eritròcits amb una obertura de 50 µm i un altre de leucòcits amb una obertura de 100 µm.

A partir dels valors  de partícules el comptador té capacitat per calcular: Hc, VCM, HCM, CHCM

Preparació de la mostra

Preparar uns vials de recompte, als quals s'hi afegeixen 20 ml de solució isotònica. Per a cada mostra tindrem preparats quatre vials.

1. Agafar 20 µl de sang amb una pipeta, després d'haver agitat suaument el tub que conté la sang per evitar la sedimentació parcial. Netegeu la pipeta per fora per evitar l'excés de mostra.
2. Introduir la mostra en un dels vials. Aquest procés ho farem per duplicat. Així tindrem la primera dilució.
3. Agitem els vials en què tenim la primera dilució, prenem 200 µl amb una pipeta i els posem en un altre vial que només contingui els 20 ml de solució isotònica. Ara ja podem posar aquesta segona dilució al comptador automàtic de cèl·lules.

Comptatge d'eritròcits

https://hdl.handle.net/2445/5662

En el bany d'eritròcits, aquests són identificats com a partícules de mesura igual o superior a 36 fl.

En aquest bany també es duen a terme el recompte de plaquetes (volum entre 2 i 20 fl).

Comptatge de leucòcits

https://hdl.handle.net/2445/5661

A continuació les cèl·lules són diluïdes amb diluent isotònic i passen al bany de leucòcits, on s'aplica un agent que lisa els eritròcits i leucòcits, de manera que queden els nuclis dels leucòcits intactes (els eritròcits no tenen nucli) i les partícules amb un volum de 35 fl o més són comptades com a leucòcits.

Valoració de l'hemoglobina

Per a la valoració de l’Hb, l’agent lisant reacciona amb l’hemoglobina lliure i el color resultant es llegeix a 540 nm.

Comptatge amb analitzador hematològic automàtic Spincell 3

https://youtu.be/7NtP8wL5uuQ

Analitzador hematològic de 3 poblacions dissenyat per oferir resultats exactes i precisos amb un alt rendiment de 72 mostres per hora. El sistema econòmic de només dos reactius i volum de mostra reduït de 13 μL optimitza els costos operatius. Compte amb una pantalla LCD a color de 10,4 polzades i funcions de neteja automàtica per garantir un manteniment senzill. Ideal per a laboratoris que busquen eficiència, facilitat d'ús i fiabilitat en les anàlisis diàries.

Índexs hematimètrics

La relació entre els valors hemàtics d'hematòcrit o Htc (volum cel·lular × 100/volum de sang), comptatge o Rc (milions d'eritròcits/mm3) i concentració d'hemoglobina o Hb (g Hb/100 ml sang) permeten calcular els índexs hematimètrics. Tenen interès perquè presenten variacions entre els diferents vertebrats i permeten interpretar alteracions patològiques, com ara les anèmies.

Volum corpuscular mitjà

El volum corpuscular mitjà (VCM) és el volum mitjà dels eritròcits i ve donat per l'expressió: VCM = (Htc × 10) / Rc on Rc representa el nombre d'eritròcits en milions per mm3 de sang.

Hemoglobina corpuscular mitjana

Hemoglobina corpuscular mitjana (HbCM) és la quantitat mitjana de Hb per eritròcit. S'expressa en picograms i es pot calcular seguint l'expressió: HbCM = (Hb × 10) / Rc on Hb és la concentració d'hemoglobina a g/100 ml sang i Rc els milions d'eritròcits per mm3 de sang.

Concentració d'hemoglobina corpuscular mitjana

Concentració d'hemoglobina corpuscular mitjana (CHbCM) és la concentració mitjana d'hemoglobina dels eritròcits, és a dir, la quantitat (en g) que hi ha a 100 ml de glòbuls; ve donada per l'expressió: CHbCM = Hb/(Htc/100) = Hb × (100/Htc).

Valors de referència

Valors de referència d'un hemograma

L'hemograma és la part de l'analítica que avalua diversos paràmetres de la sang, com són els glòbuls vermells, les cèl·lules de defensa o glòbuls blancs, així com les plaquetes i els factors de coagulació.

Sèrie vermella: es valora essencialment el nombre d’eritròcits (hematies o glòbuls vermells) que hi ha a la sang, el percentatge de sang que ocupen, la quantitat d'hemoglobina que té cadascun de mitjana, la forma i el volum, entre altres paràmetres. Aquests paràmetres permeten estudiar estats d'anèmia, entre altres malalties.

 Sèrie blanca: permet valorar estats d'infecció o d'alteracions de la immunitat. No es diferencien els valors en funció del gènere i s'expressen tant en números totals com en percentatges del tipus de leucòcits.

Plaquetes i capacitat de coagulació: valora els factors de coagulació

Tipus principals d'anèmies

• Nivell d’hemoglobina per unitat de volum baix. Transport O2 insuficient
• Els tres paràmetres hemàtics (RBC, Hb, Hc) poden evolucionar independentment
• Cal valorar-los conjuntament per poder diagnosticar el tipus